Visualizzazione del disordinato meccanismo di trasporto nucleare in situ
Natura volume 617, pagine 162–169 (2023) Citare questo articolo
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Il complesso dei pori nucleari dei mammiferi (NPC), di circa 120 MDa, funge da guardiano del trasporto tra il nucleo e il citosol1. Il canale centrale dell'NPC è pieno di centinaia di proteine intrinsecamente disordinate (IDP) chiamate FG-nucleoporine (FG-NUP)2,3. Sebbene la struttura dell'impalcatura NPC sia stata risolta in notevole dettaglio, l'effettivo meccanismo di trasporto costruito dagli FG-NUP - circa 50 MDa - è raffigurato come un buco di circa 60 nm anche in tomogrammi altamente risolti e/o strutture calcolate con metodi artificiali. intelligenza4,5,6,7,8,9,10,11. Qui abbiamo sondato direttamente le conformazioni dell'FG-NUP98 vitale all'interno degli NPC nelle cellule vive e nelle cellule permeabilizzate con un macchinario di trasporto intatto utilizzando un approccio di etichettatura di piccole molecole sito-specifico abilitato dalla biologia sintetica abbinato a una microscopia a fluorescenza altamente risolta nel tempo. Le misurazioni di singole cellule permeabilizzate della distribuzione della distanza dei segmenti FG-NUP98 combinate con simulazioni molecolari a grana grossa dell'NPC ci hanno permesso di mappare l'ambiente molecolare inesplorato all'interno del canale di trasporto di dimensioni nanometriche. Abbiamo determinato che il canale fornisce, nella terminologia della teoria dei polimeri di Flory12, un ambiente con un "buon solvente". Ciò consente al dominio FG di adottare conformazioni espanse e quindi di controllare il trasporto tra il nucleo e il citoplasma. Con oltre il 30% del proteoma formato da IDP, il nostro studio apre una finestra sulla risoluzione delle relazioni disturbo-funzione degli IDP in situ, che sono importanti in vari processi, come la segnalazione cellulare, la separazione di fase, l’invecchiamento e l’ingresso virale.
Gli IDP sono macromolecole flessibili e dinamiche prive di una struttura terziaria fissa e possono adottare una gamma di conformazioni per svolgere varie funzioni all'interno della cellula. Gli IDP sono molto rilevanti per la fisiologia umana e hanno un ruolo centrale, tra gli altri, nelle malattie neurodegenerative dell’invecchiamento e nel cancro. Gli IDP sono anche attori chiave nella separazione di fase e sono coinvolti nella formazione di condensati biomolecolari13,14,15,16,17,18,19,20,21. Nell'NPC nanometrico, che ha un peso molecolare totale di circa 120 MDa nei mammiferi, sono presenti centinaia di IDP arricchiti in residui di fenilalanina (F) e glicina (G), noti come FG-NUP1. Gli FG-NUP formano una barriera di permeabilità nel canale centrale dell'NPC, che regola il trasporto nucleocitoplasmatico limitando il passaggio di carichi di grandi dimensioni a meno che non presentino una sequenza di localizzazione nucleare o una sequenza di esportazione nucleare2,3. I recettori del trasporto nucleare possono riconoscere specificamente queste sequenze e trasportare in modo efficiente il carico attraverso la barriera. Con i recenti progressi nella tomografia crioelettronica, nella cristallografia, nella proteomica e nella previsione della struttura basata sull'intelligenza artificiale (AI), circa 70 MDa dell'impalcatura NPC che racchiude il canale centrale sono stati risolti con una risoluzione quasi atomica4,5,6,7,8 ,9,10,11. Tuttavia, i segnali provenienti dagli FG-NUP altamente dinamici non sono generalmente accessibili a quelle tecniche di biologia strutturale e l'effettivo meccanismo di trasporto all'interno del canale centrale - altri circa 50 MDa - non viene catturato, lasciando un buco di circa 60 nm nel canale centrale. centro della struttura dell'impalcatura. Di conseguenza, lo stato conformazionale della proteina all'interno dell'NPC rimane sfuggente, il che ha portato a diverse ipotesi parzialmente contrastanti per le morfologie dei domini FG nel loro stato funzionale22,23,24,25,26,27,28. Dato che circa il 30% dell'intero proteoma eucariotico è intrinsecamente disordinato, il problema che lo stato conformazionale non è facilmente studiabile nelle cellule si estende ben oltre la biologia degli NPC. Oltre alle tecniche di risonanza magnetica e scattering13,14, la fluorescenza di singole molecole di proteine purificate e marcate è diventata un potente strumento per sondare le conformazioni delle proteine in soluzione; studi avanzati hanno dimostrato che ciò è possibile anche nelle cellule se tali sonde vengono microiniettate29,30,31. Tuttavia, l'NPC viene assemblato solo nella tarda mitosi e durante la crescita nucleare nell'interfase32, e la sua etichettatura richiede quindi una codifica genetica. Le tecnologie consolidate basate su proteine fluorescenti come GFP o tag proteici autoetichettanti come SNAP-tag33, tuttavia, non consentono facilmente l'estrazione di distribuzioni di distanze multiple per la stessa proteina, a causa delle dimensioni dell'etichetta fluorescente e della natura intrinseca libertà limitata di etichettatura.